监管的底物识别MiaA tRNA prenyltransferase修饰酶的大肠杆菌k - 12。
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梁HC,陈Y,温克勒我
监管的底物识别MiaA tRNA prenyltransferase修饰酶的大肠杆菌k - 12。
生物化学杂志。1997年5月16日;272 (20):13073 - 83。
- PubMed ID
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9148919 (在PubMed]
- 文摘
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我们纯化polyhistidine (His6)标记和本地大肠杆菌MiaA tRNA prenyltransferase,它使用dimethylallyl二磷酸(DMAPP) isopentenylate残留毗邻大多数tRNA物种的反密码子阅读密码子从U残留。动能和绑定的研究纯化MiaA与多个基板进行,包括合成野生型tRNAPhe tRNAPhe的茎环结构(ACSLPhe)反密码子,从MiaA突变和散装tRNA孤立。凝胶过滤转变和稳态动力学决定显示affinity-purified MiaA和本地MiaA相同的属性,完全活跃tRNAPhe绑定。MiaA有Kmapp (tRNA基质)约3海里,这是数量级低于其他净化tRNA修饰酶,一种Kmapp (DMAPP) = 632 nM, kcatapp = 0.44 s - 1。MiaA活动最低限度影响其他修改或nonsubstrate tRNA物种存在于大部分tRNA孤立MiaA突变。MiaA修改ACSLPhe kcatapp / Kmapp底物特异性约17倍低于完整tRNAPhe,主要是由于底物亲和力下降明显。beplayapp定量免疫印迹显示MiaA西部是一个丰富的蛋白质在指数增长的细菌(660单体细胞;1.0 microM浓度)和存在于催化过剩。然而,MiaA活动强烈竞争性抑制的DMAPP ATP和ADP (Kiapp = 0.06 microM),这表明MiaA活动大幅抑制体内,DMAPP可能绑定到这类prenyltransferases守恒P-loop图案。带转变,滤波器绑定和凝胶过滤转变实验支持模型MiaA tRNA基质被紧密地绑定到MiaA多聚体可能积极合作的方式(Kdapp大约0.07 microM)。