催化作用的伴脯氨酸在4-oxalocrotonate tautomerase:亲和标签和异核核磁共振研究。
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Stivers称JT, Abeygunawardana C, Mildvan, Hajipour G,惠特曼CP,陈LH
催化作用的伴脯氨酸在4-oxalocrotonate tautomerase:亲和标签和异核核磁共振研究。
生物化学。1996年1月23日,35(3):803 - 13所示。
- PubMed ID
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8547260 (在PubMed]
- 文摘
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4-Oxalocrotonate tautomerase (EC 5.3.2 -;4-OT),每单元由62组成的六聚体残留,催化不饱和alpha-keto酸异构化,将非结合的酮通过dienolic中间共轭的同分异构体。最近解决了同工酶的晶体结构4-OT表明伴脯氨酸催化基础[Subramanya, h·S。罗珀,d . I。爱抚,Z。道森,e . J。戴维斯,g . J。威尔逊,k . S。& Wigley, d . b .(1996)生物化学35岁,792 - 802]。支持这个建议的作用,我们发现active-site-directed不可逆抑制剂3-bromopyruvate (3-BP)块4-OT埃德曼降解和结果的氨基末端的消失15 n共振Pro-1(δ= 49.2 ppm的pH值6.40和42摄氏度)的15 n核磁共振光谱一致15 n-labeled 4-OT。此外,15 N之间的共价键4-OT共振和亚甲基碳的减少,3 - (13)C-labeled lactyl加合物来自[3 - (13)C] -bromopyruvate当时直接演示了使用两个异核核磁共振方法,一个1 H - (13) C HSQC实验和小说逆相关实验我们称之为H (C) N。修改后的15 n的化学位移共振(δ= 86.5 ppm)是一致的烷基化和阳离子,伴脯氨酸。亲和标签与2 - (14)C-labeled bromopyruvate表明修改的最终化学计量学是我枚3-BP / 4-OT单体。然而,残余酶活性的分析与3-BP表明不同区段的部分修改后修改三个活跃网站每六聚体破坏基本上六聚体的所有活动。 Thus, 4-OT exhibits half-of-the-sites stoichiometry with 3-BP. Finally, the pH dependence of kinact/KI for affinity labeling by 3-BP yields a pKa value of 6.7 +/- 0.3, in reasonable agreement with the pKa values found for kcat/KM for the non-sticky substrate 2-hydroxy-2,4-pentadienoate and by direct NMR titration of Pro-1 [Stivers, J. T., Abeygunawardana, C., Mildvan, A. S., Hajipour, G., & Whitman, C. P. (1996) Biochemistry 35, 814-823]. These results strongly implicate the amino-terminal proline as the general-base catalyst on 4-OT.