Mannanase从荧光假ssp。cellulosa留住糖基水解酶中,E212和E320是公认的催化残基所中断。
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Bolam DN,休斯N, Virden R, Lakey JH, Hazlewood GP, Henrissat B,布雷斯韦特KL,吉尔伯特HJ
Mannanase从荧光假ssp。cellulosa留住糖基水解酶中,E212和E320是公认的催化残基所中断。
生物化学。1996年12月17日,35 (50):16195 - 204。
- PubMed ID
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8973192 (在PubMed]
- 文摘
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Mannanase荧光假的(魔法),糖基水解酶家族中的一员26日在大肠杆菌和纯化hyperexpressed同质性。mannotetraose水解的立体化学的课程分析纯化法力显示异头碳的配置是保留的乳沟中间糖苷键。这些数据表明,mannanase复分解一般酸碱水解mannooligosaccharides的机制。由疏水聚类分析(HCA),两个谷氨酸和天冬氨酸残基被证明是守恒的在所有的糖基水解酶家族26酶分析。此外,HCA相关建议家庭26了一家族(家庭1、2、5、10、30、35岁,39岁,和42)的(α/β)8-barrel糖基水解酶,导致预测E320 E212构成催化亲核试剂和酸碱残留物所中断,分别。调查这些氨基酸的作用,定点诱变用于替换这两个天冬氨酸与丙氨酸和谷氨酸,而改为丙氨酸两个守恒的谷氨酸和天冬氨酸。突变酶的纯化及其生化特性进行了分析。数据表明,D - - >和D - - > E突变导致酶活性显著降低,表明这两个天冬氨酸残基没有催化作用中发挥关键作用。相比之下,修改的谷氨酸残基的丙氨酸引起急剧减少kcat角豆半乳甘露聚糖,azo-carob半乳甘露聚糖,mannotetraose和2,4-dinitrophenyl beta-mannobioside (2, 4-DNPM)。E320A突变并没有改变明显的K (K (m)) (m)的法力与这些基质,而E212A导致27倍降低K (m)对2,4-DNPM。 Pre-steady-state kinetics of 2,4-DNPM hydrolysis by E212A showed that there was a rapid burst of 2,4-dinitrophenol release. Circular dichroism and fluorescence spectroscopy indicated that there were no significant differences between the structures of the mutant and wild-type forms of MANA. These data are consistent with E212 and E320 constituting the catalytic acid-base and nucleophile residues of MANA, respectively.